脂質(zhì)納米顆粒在當(dāng)前SARS-CoV-2臨床試驗中的應(yīng)用

1 BioNTech/輝瑞

BioNTech在SARS-COV-2試驗的遞送系統(tǒng)脂質(zhì)成分主要是Acuitas的ALC-0315(表2)、DSPC、膽固醇和PEG-脂質(zhì)。CureVac和倫敦帝國理工學(xué)院可能也使用ALC-0315或A9(表2)。BioNTech開始用四種mRNA編碼的免疫原開發(fā)SARS-CoV-2疫苗，其中兩種是核苷修飾的，一種是未修飾的，一種是自擴(kuò)增的。

其中有關(guān)兩種核苷修飾的mRNA:BNT162b1是一種較短的、約1 kb的序列，其編碼刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由折疊三聚結(jié)構(gòu)域修飾，通過多價顯示增加其免疫原性；

另一種BNT162b2是較長的、約4.3 kb的薛烈，其編碼二脯氨酸穩(wěn)定的全長的膜結(jié)合刺突蛋白。BNT162b2最近獲得了歐盟和美國的緊急批準(zhǔn)。在一項臨床前研究中，單次給藥0.2、1和5µg的BNT162b2后，可檢測到小鼠體內(nèi)的結(jié)合抗體和中和效價，從**劑量到**劑量增加一個數(shù)量級，并在Th2細(xì)胞因子水平非常低的CD4+和CD8+脾細(xì)胞中引起強(qiáng)烈的抗原特異性Th1 IFNγ和IL-2反應(yīng)。引流淋巴結(jié)也含有大量生發(fā)中心B細(xì)胞和CD4+和CD8+ T濾泡輔助細(xì)胞(Tfh)的數(shù)量也升高，這些細(xì)胞以前被認(rèn)為是由mRNA LNP疫苗中LNP單獨(dú)誘導(dǎo)。

在非人的靈長類動物中，30 µg或100 µg的免疫增強(qiáng)劑量引起的結(jié)合抗體和中和效價是人類恢復(fù)期組的10倍以上，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1偏向性T細(xì)胞反應(yīng)，這對預(yù)防疫苗相關(guān)的增強(qiáng)型呼吸道疾病很重要。在6只的獼猴中，兩次給藥100 µg后在支氣管肺泡灌洗液和鼻拭子中檢測不到病毒效價。對較小的mRNA編碼免疫原BNT162b1的1期臨床試驗中計劃在第1天和第21天給藥10、30和100 µg。中等劑量30 µg誘導(dǎo)的抗體結(jié)合和中和效價分別比人類恢復(fù)期組高30倍和3倍。由于第一次給藥后出現(xiàn)嚴(yán)重的注射部位疼痛，因此未給予100 µg劑量的增強(qiáng)劑量。給藥30 µg的增強(qiáng)劑量后100%的受試者產(chǎn)生輕度或中度的注射部位疼痛。第二次接種30 µg劑量后，幾乎所有受試者都經(jīng)產(chǎn)生了輕度或中度的全身不良反應(yīng)，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)或疲勞。該試驗還證明了來自外周血單核細(xì)胞有強(qiáng)Th1偏向性T細(xì)胞反應(yīng)。

一項2期臨床試驗比較了年輕(18-55歲)和年長(65-85歲)受試者組接種 BNT162b1和BNT162b2后的一些指標(biāo)。老年組的結(jié)合和中和抗體效價略低，但仍高于恢復(fù)期組的受試者。與年輕組相比，老年組的不良反應(yīng)嚴(yán)重程度也降低了。BNT162b2與BNT162b1相比，全身不良反應(yīng)(發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲勞)的發(fā)生率**降低了約兩倍。正是BNT162b2耐受性的增加推動了其3期臨床試驗，最近該試驗宣布有效率達(dá)到94%，因為安慰劑組出現(xiàn)了162例感ran，而接受兩次30 µg劑量BNT162b2的接種組*發(fā)現(xiàn)8例感ran。

2 Moderna

在Moderna的研究中，核苷修飾的mRNA編碼的免疫原是一種跨膜錨定的二脯氨酸穩(wěn)定的預(yù)融合刺突，具有天然的呋喃裂解位點(diǎn)，并以LNP遞送，該LNP參照MC3 LNP原型，但用脂質(zhì)H (SM-102)替代MC3。mRNA LNP (mRNA-1273)接種劑量為1 µg而非0.1 µg，小鼠接種第1天和第21天，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。T細(xì)胞反應(yīng)似乎是一種Th1/Th2平衡的反應(yīng)，在小鼠的病毒模型中，兩次給藥1 µg（非0.1 µg）后，小鼠肺部和鼻甲的病毒效價降低到基線。以獼猴為實(shí)驗對象，兩次給藥劑量為100 µg，給藥后能產(chǎn)生高結(jié)合和中和效價以及在外周血中產(chǎn)生Th1偏向反應(yīng)，同時也有強(qiáng)Tfh反應(yīng)。兩次給藥10 µg劑量后效價和T細(xì)胞反應(yīng)**降低。

同樣，100 µg劑量能夠?qū)⒅夤芊闻莨嘞匆汉捅鞘米又械牟《拘r降低到基線水平，而10 µg劑量*在肺部有效。在一項1期臨床研究中，每組15名患者，給藥頻率為間隔4周2次，給藥劑量為25、100或250 µg，100 µg劑量的結(jié)合和中和效價比恢復(fù)期高約10倍，相當(dāng)于25 µg的恢復(fù)期。所有受試者在100 µg和250 µg劑量下均產(chǎn)生了不良反應(yīng)，250 µg組的14名受試者中有3名發(fā)生了嚴(yán)重的不良反應(yīng)，并被停藥。在隨后對老年患者(56-71歲和71歲以上)進(jìn)行的1期臨床研究中，發(fā)現(xiàn)25 µg和100 µg劑量產(chǎn)生的結(jié)合抗體效價高于恢復(fù)期血漿中的，而中和效價與100 µg相當(dāng)，但低于恢復(fù)期的25 µg。

即使是在老年組也有約80%的患者在第二次接種疫苗后仍出現(xiàn)不良反應(yīng)。外周血分析顯示CD4 T細(xì)胞反應(yīng)是Th1偏向型的。與25 µg劑量相比，100 µg劑量的中和效價更高，因此進(jìn)一步進(jìn)行了3期臨床試驗，中期結(jié)果顯示，安慰劑組出現(xiàn)了90例感ran，而接種疫苗組只有5例感ran，防護(hù)有效率達(dá)到94.5%。一**委員會對Moderna的3期臨床試驗的中期分析結(jié)果表明，出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)包括：9.7%的接種者出現(xiàn)疲勞、8.9%的接種者出現(xiàn)肌肉疼痛、5.2%的接種者出現(xiàn)關(guān)節(jié)tong、4.5%的接種者出現(xiàn)**，而在輝瑞/BioNTech的3期臨床試驗中，出現(xiàn)疲勞的頻率較低，只有3.8%，**為2%。

3 CureVac

CureVac mRNA LNP (CVnCoV)采用的是一種非化學(xué)修飾的、序列工程mRNA，它編碼一種二脯氨酸穩(wěn)定的全長的S蛋白，采用Acuitas LNP遞送技術(shù)，可能使用可電離脂質(zhì)ALC-0315。小鼠實(shí)驗中劑量為2 µg時，對兩次給藥之間的周數(shù)（從1到4不等）進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)較長的時間間隔在Balb/c小鼠中產(chǎn)生更高的效價和T細(xì)胞反應(yīng)以及平衡的Th1/Th2反應(yīng)。產(chǎn)生中和抗體需要第二次給藥，兩次給藥0.25 µg不足以產(chǎn)生中和抗體。在敘利亞金黃地鼠實(shí)驗中，兩次給藥10 µg (非2 µg)能夠?qū)⒎?非鼻甲)中的病毒效價降低到基線。在劑量為2-12 µg的1期臨床試驗中，*在**劑量12 µg時發(fā)現(xiàn)中和效價達(dá)到恢復(fù)期血清水平，這使得較高劑量（16和20 µg）被納入正在進(jìn)行的2期臨床試驗。所有給藥劑量為12 µg的患者在每次給藥后都產(chǎn)生了全身不良反應(yīng)，大多數(shù)為中度和重度，而> 80%的患者在局部注射部位產(chǎn)生了輕度和中度疼痛。

4 TranslateBio

Translate Bio使用的是一種非修飾的mRNA，其編碼雙突變的二脯氨酸穩(wěn)定的刺突蛋白，采用LNP技術(shù)平臺，使用可電離脂質(zhì)C12-200，C12-200很可能是近期的基于ICE-或半胱氨酸的可電離脂質(zhì)家族合成的候選物。在Balb/c小鼠實(shí)驗中，發(fā)現(xiàn)在0.2-10 µg范圍內(nèi)兩次給藥使結(jié)合和中和效價遠(yuǎn)高于恢復(fù)期水平。在非人的靈長類動物實(shí)驗中，15、45和135 µg劑量均產(chǎn)生超過人類恢復(fù)期的效價，并且其免疫反應(yīng)也是Th1偏向型的。

5 Arcturus

Arcturus使用的是一種自擴(kuò)增的、全長的、未修飾的mRNA，其編碼融合前SARS-CoV-2全長的刺突蛋白，該LNP中使用帶有硫酯的可電離脂質(zhì)，通過兩個額外的酯基將含胺的頭部和脂質(zhì)尾部相連接。這個脂質(zhì)家族中兩種可能的可電離脂質(zhì)是脂質(zhì)10a(在[111]的表4中)或脂質(zhì)2，2 (8，8) 4CCH3(在[57]的第33頁上)(表2)。

后者有三個分支，類似于Moderna脂質(zhì)H，但有一個可降解的硫酯連接到頭部。自擴(kuò)增mRNA的一個特征是熒光素酶基因的表達(dá)在肌肉注射給藥一周后保持在相當(dāng)恒定的水平，而常規(guī)mRNA的表達(dá)則迅速下降。在C57BL/6小鼠中，單獨(dú)接種疫苗使體重減輕和臨床評分增加。在具有高水平抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的Th1偏向反應(yīng)中，只需要對小鼠以2 µg或10 µg(非0.2 µg)的劑量單次給藥，就可以使中和效價達(dá)到100以上。在K18-hACE2小鼠致死模型中，單次給藥2 µg或10 µg也可以100%保護(hù)小鼠，并且小鼠體重沒有減輕，且肺和腦的病毒效價降低到基線。Arcturus已經(jīng)完成了接種劑量為1-10 µg的1期臨床試驗，并選擇使用7.5 µg作為接種劑量進(jìn)行3期臨床試驗。

6倫敦帝國理工學(xué)院

倫敦帝國理工學(xué)院使用了一種由Acuitas LNP技術(shù)遞送的、自擴(kuò)增的編碼預(yù)融合的穩(wěn)定的刺突蛋白的mRNA，該蛋白在由脂質(zhì)A9的**中有所描述(表2)。在Balb/c小鼠中兩次注射0.01 µg至10 µg的劑量后，產(chǎn)生了非常高的劑量依賴性抗體和中和效價。該反應(yīng)是強(qiáng)Th1偏向型，與較低的0.1和0.01 µg劑量相比，10和1 µg的劑量產(chǎn)生了高三倍的抗原特異性脾細(xì)胞反應(yīng)。該疫苗即將開始1期臨床試驗。

7 朱拉隆功大學(xué)，賓夕法尼亞大學(xué)

朱拉隆功大學(xué)與賓夕法尼亞大學(xué)合作，使用Genevant LNP技術(shù)開發(fā)一種天然刺突免疫原核苷修飾的mRNA LNP，采用的脂質(zhì)可能是CL1。他們的目標(biāo)是于2021年第一季度開始第一階段臨床試驗，并于2021年第四季度開始向泰國和七個周邊中低收入國家供應(yīng)疫苗。

8 Providence Therapeutics

Providence Therapeutics獲得了加拿大衛(wèi)生部的授權(quán)通知，可以對疫苗進(jìn)行人體臨床試驗。對編碼受體結(jié)合域（具有或不具有呋喃裂解位點(diǎn)突變的全長刺突蛋白）的三種候選mRNA進(jìn)行臨床前研究，按照免疫增強(qiáng)方法以C57BL6小鼠為實(shí)驗對象以20 µg的劑量給藥。

該疫苗使用來自Genevant的未公開脂質(zhì)（可能與表2中的CL1相似）的臨床前數(shù)據(jù)，顯示出全長的和呋喃突變的有效載荷具有強(qiáng)大的中和效價。第一階段臨床試驗計劃于2021年第一季度開始，同時疫苗的生產(chǎn)和銷售計劃于同年獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。

9 儲存和供應(yīng)

實(shí)驗室制造的大多數(shù)RNA LNP可以在4℃下保存幾天，但隨后出現(xiàn)顆粒尺寸增加和生物活性逐漸喪失（如熒光素酶表達(dá)）的特點(diǎn)。在以前的siRNA LNP方中，通常由于LNP聚集導(dǎo)致尺寸隨著時間增大。為了mRNA LNP疫苗能穩(wěn)定的儲存和供應(yīng)，需要采用冷凍形式。Moderna的疫苗需要在-25℃至-15℃之間儲存，在2℃至8℃之間可穩(wěn)定儲存30天，在8℃至25℃可穩(wěn)定儲存12小時。

輝瑞/BioNTech的疫苗需要在-80℃至-60℃之間儲存，解凍之后在2℃至8℃之間儲存最多5天，然后在注射前用鹽水稀釋。在儲存和運(yùn)輸過程中，輝瑞疫苗所需的極低溫度比Moderna疫苗所需的常規(guī)冷凍溫度更難達(dá)到。這些溫度差異背后的原因并不明顯，因為兩種疫苗都含有類似的高濃度蔗糖作為冷凍保護(hù)劑。Moderna的mRNA LNPs被冷凍在Tris和醋酸鹽兩種緩沖液中，而輝瑞/BioNTech疫苗*使用磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液不適合冷凍，因為它們?nèi)菀壮恋矶医Y(jié)晶會引起pH突變。凍干工藝對mRNA LNPs來說是一個技術(shù)難點(diǎn)。然而，Arcturus已經(jīng)聲明，他們的mRNA疫苗在凍干形式中是穩(wěn)定的，盡管這種凍干制劑的溫度穩(wěn)定性尚未公開，但這可能會**簡化供應(yīng)。

脂質(zhì)納米顆粒

許多脂質(zhì)樣實(shí)體，稱為脂質(zhì)類化合物類脂，最初是為siRNA遞送而開發(fā)的，隨后用于mRNA遞送。C12-200就是一個例子(表2)，由于其通過靜脈給藥在肝細(xì)胞基因沉默中的高效性，而在類脂家族中脫穎而出。為了實(shí)現(xiàn)高效的肝臟靶向基因沉默，C12-200與MC3 Onpattro原型相同的脂質(zhì)相結(jié)合，即50%可電離脂質(zhì)、10% DSPC、38.5%膽固醇和1.5% PEG-脂質(zhì)。

后來的一項研究發(fā)現(xiàn)，通過將可電離脂質(zhì)的百分比降低到35%，同時將可電離脂質(zhì)與核酸的重量比從5增加到10，并用促細(xì)胞融合的不飽和DOPE取代DSPC，可以將C12-200對同一肝臟靶點(diǎn)的mRNA遞送效率提高7倍。

有趣的是，這種優(yōu)化的方將mRNA表達(dá)提高了7倍，但沒有改變siRNA的沉默效率。在這種方中，C12-200也被研究用于小鼠和非人靈長類動物的mRNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)替代療法，但是當(dāng)皮下注射時，通過組織學(xué)觀察，它會產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。C12-200是一種小分子樹狀聚合物，具有五個烷基鏈和五個氮原子，根據(jù)ACDLabs Percepta等商用軟件進(jìn)行電離分析，發(fā)現(xiàn)其中三個似乎是可質(zhì)子化的(表2)。另一種樹枝狀大分子脂質(zhì)，5A2-SC8，在觀察過程中發(fā)現(xiàn)對肝臟具有高siRNA傳遞效率，并且還具有五個氮原子和五個短烷基鏈(表2)。

類脂5A2-SC8對于mRNA遞送的效率很低，除非通過將可電離的脂質(zhì)摩爾分?jǐn)?shù)降低到24%，使用DOPE代替DSPC，并增加其他脂質(zhì)比例來改變其方參數(shù)，但是同時5A2-SC8與mRNA的重量比將增加到20。

這些方的改變似乎是這些樹枝狀大分子型類脂成為有效的mRNA遞送載體所必需的，這可能是因為它們具有多質(zhì)子的頭部和樹枝狀大分子結(jié)構(gòu)。另一種非常高分子量的修飾樹枝狀大分子被用于遞送編碼流感、埃博拉和弓形蟲免疫原的自擴(kuò)增mRNA，并且在小鼠實(shí)驗中，在單次給藥40 µg的高劑量或免疫增強(qiáng)方法注射4 µg后(這對復(fù)制RNA也是高劑量)，發(fā)現(xiàn)可以避免三種病原體的感ran。最近對類脂進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，與其他類脂相比，這種小的三氮樹枝狀大分子的四個烷基鏈末端增加一個碳支鏈，肝臟表達(dá)能力提高了10倍以上。

這種效價的增加與LNP的pKa值沒有相關(guān)性，但與pH為 5時TNS染料的**熒光有相關(guān)性，這表明內(nèi)涵體質(zhì)子化的幅度與mRNA表達(dá)相關(guān)，推測可能是促進(jìn)內(nèi)涵體逃逸。根據(jù)分子形狀假說，增加的碳支鏈也可以產(chǎn)生一個更錐形的結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生更多的膜破裂。

編碼抗體基因的mRNA LNP的遞送

目前市場上有70多種單克隆抗體（mAbs），全球銷售額為1250億美元。使用mRNA編碼的抗體具有以下優(yōu)勢，包括有益于天然翻譯后修飾的內(nèi)源性蛋白質(zhì)合成，以及是一種不需要細(xì)胞培養(yǎng)和對蛋白質(zhì)產(chǎn)品大量純化和表征的簡化生產(chǎn)方法。通過將編碼VRC01（一種針對HIV-1的中和抗體）輕鏈和重鏈的純化核苷修飾的mRNA包封到Acuitas LNPs中，顯示出遞送mRNA編碼的mAbs可能用于被動免疫。

以 Balb/c小鼠為實(shí)驗對象，靜脈注射30 µg mRNA LNP（靶向肝細(xì)胞），表達(dá)mAbs超過一周，血清水平達(dá)到150 µg/ml，高于直接注射600 µg mAbs，每周注射能夠保持血清水平在40 µg/ml以上。CD34-NSG人源化小鼠注射30 µg和15 µg的mRNA LNP可以抵御24小時后的HIV-1攻擊，入侵2周后的血清病毒RNA復(fù)制分析也證明這一觀點(diǎn)。

CureVac的一項研究證實(shí)了**性非修飾mRNA編碼抗體的可行性，該研究也使用了Acuitas LNPs，其中選擇了對多種狂犬病毒株具有**中和能力的IgG mAbs，以及針對肉毒桿菌**的純重鏈Vh結(jié)構(gòu)域(VHH)中和劑。還生產(chǎn)了一種靶向CD20的、mRNA編碼的利妥昔單抗，其中CD20是非霍奇金淋巴瘤**的**。

動物實(shí)驗通過靜脈注射使用的是靶向肝細(xì)胞的Acuitas LNP。小鼠單次給藥40 µg產(chǎn)生的血清抗體水平剛剛超過10 µg/ml，1個月后逐漸下降到1 µg/ml。相同劑量下，VHH單結(jié)構(gòu)域中和劑產(chǎn)生的抗體水平高10倍，但由于缺乏Fc區(qū)，半衰期*有幾天。當(dāng)在狂犬病病毒的致命攻擊之前1天或之后2小時，對小鼠單次靜脈注射40 µg也能夠*保護(hù)小鼠。

同樣，在致命的肉毒桿菌**攻擊后6小時單次給藥40 µg也*保護(hù)了動物。第三個攻擊模型是將Raji-luc2 B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞靜脈移植并且生長4天，然后在18天內(nèi)，在Acuitas LNP中5次給藥10或50 µg mRNA編碼的利妥昔單抗，結(jié)果是保護(hù)了所有動物，并且50 µg劑量能夠*消除**生長。

將T細(xì)胞募集到**細(xì)胞的雙特異性抗體也被編碼在修飾的mRNA結(jié)構(gòu)中，并使用商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑TransIT在體內(nèi)遞送，該試劑在肝臟遞送方面不如目前的LNP有效。

該mRNA結(jié)構(gòu)可維持循環(huán)和生物活性的雙特異性抗體超過6天，而相同5 µg劑量的蛋白質(zhì)-雙特異性抗體在**后減少至接近基線。第二項研究也是使用VHH形式的雙特異性抗體進(jìn)行的，其中一個結(jié)合保守的甲型流感基質(zhì)蛋白2外域(M2e)的VHH基因與另一個小鼠Fcγ受體IV (FcγRIV) 特異性結(jié)合的VHH基因相連，以便將表達(dá)FcγRIV的先天免疫細(xì)胞募集到表達(dá)M2e的流感感ran細(xì)胞中。

這些核苷修飾過結(jié)構(gòu)的mRNA使用DOTAP/膽固醇制備的LNPs遞送，通過氣管內(nèi)滴注到小鼠肺中，4小時后，用致死劑量的流感病毒攻擊，80%的小鼠免受致死劑量的影響，盡管它們產(chǎn)生明顯的體重減輕，并且DOTAP/膽固醇mRNA納米粒導(dǎo)致粒細(xì)胞暫時流入肺部，同時血清IL-6細(xì)胞因子水平也有所升高。

**，在基孔肯雅感ran幸存者的B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種有效中和抗體被編碼在一種核苷修飾的mRNA結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)由一個可能含有MC3或脂質(zhì)5的LNP遞送。靜脈注射0.5 mg/kg(10 µg)編碼mAb的mRNA，24小時預(yù)注射的小鼠獲得了抗病毒攻擊的保護(hù)作用，而注射蛋白mAb需要2 mg/kg的劑量。在感ran后4小時，對小鼠注射高劑量10 mg/kg (200 µg)，使小鼠避免感ran。非人的靈長類動物研究中發(fā)現(xiàn)，3 mg/kg(9 mg)的高劑量產(chǎn)生的短暫毒性（包括脾臟增大和CCL2血清水平升高）最小，且注射后幾個月仍可檢測到抗體。基于這些結(jié)果，Moderna啟動了一項1期臨床試驗，并公布了陽性結(jié)果，其中0.1和0.3 mg/kg的劑量耐受性良好，并且mAb的血清水平在1–14 µg/mL的范圍內(nèi)，預(yù)計單次給藥后可對基孔肯雅病毒具有長達(dá)16周的免疫作用。

脂質(zhì)納米顆粒組裝和結(jié)構(gòu)

目前mRNA脂質(zhì)納米顆粒的生產(chǎn)方法是利用微流體或T型接頭，把含有疏水性質(zhì)的乙醇相和含有mRNA的水相在pH為4的緩沖液（如乙酸）中混合（圖2）。現(xiàn)有的方法（如薄膜蒸發(fā)法和乙醇注入法），由于納米粒子粒徑不穩(wěn)定、mRNA包封率較低、難以擴(kuò)大規(guī)模而很少使用。微流體混合的優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)⒁掖贾蟹浅Ｐ◇w積的脂質(zhì)與幾十µL水溶液中的mRNA混合，從而可以篩選許多成分和方參數(shù)。另一方面，T型接頭混合器是大批量商業(yè)生產(chǎn)mRNA LNPs的通用方法，例如目前臨床試驗中使用的方法。

最近的一份期刊表明，這兩種方法都可以生產(chǎn)有類似大小和形態(tài)的LNP。兩種溶液的快速混合是控制粒徑< 100 nm的關(guān)鍵，從而避免了其他生產(chǎn)方法所需的尺寸減小的需要(擠出、超聲處理)。如圖2所示，由這些溶液組裝和形成LNP的過程是由疏水力和靜電力驅(qū)動的。四種脂質(zhì)(可電離脂質(zhì)、DSPC、膽固醇、PEG-脂質(zhì))最初可溶于乙醇，可電離脂質(zhì)非質(zhì)子化且呈電中性(圖2A)。通常將一體積的含脂質(zhì)的乙醇溶液與三體積的mRNA在pH=4的醋酸鹽緩沖液中混合，這使得脂質(zhì)接觸緩沖液時，它們變得不溶于3∶1的水/乙醇溶劑，并且可電離的脂質(zhì)質(zhì)子化攜帶正電荷，然后與mRNA的帶負(fù)電荷的磷酸骨架靜電結(jié)合(圖2B)，形成包封mRNA的脂質(zhì)顆粒，同時脂質(zhì)在主要是水的懸浮液中變得難溶。

這一過程中的一個關(guān)鍵成分是PEG-脂質(zhì)，因為PEG鏈?zhǔn)怯H水性的，從而包覆顆粒，并決定其最終的熱力學(xué)穩(wěn)定尺寸大小。通過改變PEG的摩爾分?jǐn)?shù)，可以控制LNP的大小，例如，LNP顆粒大小為100 nm時PEG-脂質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)為0.5%，而43 nm時PEG-脂質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)為3%。最近一個研究顯示，當(dāng)mRNA LNP懸浮液在水溶液緩沖液中稀釋或透析以提高pH并去除乙醇時，LNP的結(jié)構(gòu)和大小在混合后繼續(xù)發(fā)生變化。水相和脂質(zhì)相混合時初始pH值接近5.5，使可電離脂質(zhì)質(zhì)子化，其LNP的pKa接近6.5，可以與mRNA結(jié)合和包裹(圖2B，C)。

之后通過稀釋、透析或切向流過濾提高pH可以中和可電離脂質(zhì)，直到pH為7.4時可電離脂質(zhì)基本不帶電(圖2D)。當(dāng)可電離脂質(zhì)變?yōu)殡娭行詴r，它也變得更難溶解，導(dǎo)致形成更大的疏水類脂結(jié)構(gòu)域，從而促進(jìn)LNP的融合，使LNP的尺寸增大，LNP的中心形成無定形的電子致密相，主要包含與mRNA結(jié)合的可電離脂質(zhì)。據(jù)估計，在這個過程中，多達(dá)36個囊泡可以融合形成最終的LNP(圖2C，D)。使用FRET對證實(shí)了這一融合過程，并進(jìn)一步看到了PEG-脂質(zhì)在這一過程中的作用，因為混合后加入PEG-脂質(zhì)與混合前加入PEG-脂質(zhì)以相同的方式控制最終LNP的大小。這項研究和另一項使用中子散射方法的研究也表明，DSPC在LNP的**PEG層的下面形成了一個雙層結(jié)構(gòu)，其**主要是與mRNA結(jié)合的可電離脂質(zhì)(圖2D)，同時認(rèn)為膽固醇分布在整個LNP中。

圖2：mRNA脂質(zhì)納米顆粒的組裝是通過(A)在微流體或T型接頭混合器中將四種脂質(zhì)(可電離脂質(zhì)、DSPC、膽固醇、PEG-脂質(zhì))在乙醇中與mRNA在pH4左右的水溶液緩沖液中快速混合而實(shí)現(xiàn)的。

(B)當(dāng)可電離脂質(zhì)與水相接觸時，在pH~5.5范圍內(nèi)質(zhì)子化，該pH介于緩沖液的pKa和可電離脂質(zhì)的pKa之間。

(C)可電離脂質(zhì)與mRNA的陰離子磷酸骨架靜電結(jié)合，同時它在水相中經(jīng)歷具有疏水性，驅(qū)動囊泡的形成和mRNA的包裹。

(D)在初始囊泡形成后，通過稀釋、透析或過濾提高pH，中和可電離脂質(zhì)，使其疏水性增強(qiáng)，從而驅(qū)動囊泡融合，導(dǎo)致可電離脂質(zhì)與mRNA進(jìn)一步包裹在脂質(zhì)納米粒的內(nèi)部。通過給LNP提供親水性的外表、確定其熱力學(xué)穩(wěn)定的尺寸大小，PEG-脂質(zhì)的含量停止融合，在PEG-脂質(zhì)層的下面形成DSPC的雙層結(jié)構(gòu)。